Genų klonavimo ir PGR skirtumas

Pagrindinis skirtumas - genų klonavimas ir PGR
 

Daugelio DNR kopijų sintezė iš specifinio DNR fragmento yra vadinama DNR amplifikacija. Yra du pagrindiniai DNR amplifikacijos procesai, būtent genų klonavimas ir PGR. Pagrindinis genų klonavimo ir PGR skirtumas yra, genų klonavimas sukuria daugybę specifinio geno kopijų in vivo konstruodamas rekombinantinę DNR ir augdamas bakterijos-šeimininkės viduje, tuo tarpu PGR gamina milijonus specifinio DNR fragmento kopijų in vitro atliekantys pakartotinius denatūracijos ir sintezės ciklus.

TURINYS
1. Apžvalga ir svarbiausias skirtumas
2. Kas yra genų klonavimas
3. Kas yra PGR
4. Šalutinis palyginimas - genų klonavimas ir PGR
5. Santrauka

Kas yra genų klonavimas?

Genų klonavimas yra metodas, naudojamas norint nustatyti ir padauginti specifinį geną iš ekstrahuotos organizmo genominės DNR, sukuriant rekombinantinę DNR. Genominėje DNR yra tūkstančiai skirtingų genų, užkoduotų baltymams. Kai ekstrahuojama DNR, ji apima visus galimus genus, kuriuos ji gali turėti. Genų klonavimo technika leido aptikti specifinį geną iš visos DNR. Taigi genų klonavimas yra svarbi priemonė molekulinėje biologijoje.

Organų genomo bibliotekos sudarymas yra būtinas genų klonavimui, jei nėra supratimo apie atitinkamo geno vietą DNR. Genomo biblioteka sudaroma atlikus šiuos veiksmus.

1 žingsnis: Bendros DNR ekstrahavimas iš organizmo, kuriame yra norimas genas.

2 žingsnis: Apribotas ekstrahuojamos DNR skaidymas, kad būtų gauti maži valdomi fragmentai. Šį žingsnį palengvina restrikcijos endonukleazės.

3 veiksmas: Tinkamo vektoriaus parinkimas ir vektoriaus DNR atidarymas naudojant tas pačias restrikcijos endonukleazes. Bakterijų plazmidės dažniausiai naudojamos kaip vektoriai svetimoms DNR pernešti. Plazmidės yra nedideli DNR apskritimai, esantys bakterijose.

4 veiksmas: Vektorinės DNR ir suskaidytos DNR sujungimas, norint gauti rekombinantinę DNR molekulę. Šį žingsnį reguliuoja DNR ligazė.

5 veiksmas: Rekombinantinių DNR molekulių perkėlimas į bakterijas-šeimininkę. Šis žingsnis yra žinomas kaip transformacija ir atliekamas naudojant šilumos smūgį.

5 veiksmas: Transformuotų bakterijų ląstelių atranka kultūros terpėje. Transformacijos proceso pabaigoje gaunama mišrių transformuotų ir netransformuotų šeimininko ląstelių populiacija. Kadangi dominantis genas apima tik transformuotas ląsteles šeimininkus. Taigi būtina pasirinkti transformuotas ląsteles. Atranka atliekama naudojant selektyvias terpes, kuriose yra antibiotikų. Šioje atrankos terpėje auga tik transformuotos ląstelės, leidžiančios atrinkti.

6 veiksmas: Bakterijų auginimas genų bibliotekai gaminti. Šiame etape transformuotos ląstelės-šeimininkės įvedamos į šviežias auginimo terpes, užtikrinančias optimalius augimo reikalavimus. Bendros kolonijos kultūros plokštelėse atspindi to organizmo genomo biblioteką.

7 veiksmas: Rekombinantinė DNR molekulė, kurioje yra dominantis genas, turi būti patikrinta iš tūkstančių klonuotų rekombinantinės DNR fragmentų. Tai gali būti padaryta naudojant zondus, kurie žymi specifinį geną, arba specifiniai baltymai yra to geno rezultatas.

Iš visų kolonijų išsiaiškinus suinteresuotą geną, kuriame yra bakterijų kolonija, galima pasidaryti milijonus rekombinantinės plazmidės, kurioje yra geno, kopijų.

Genų klonavimas naudojamas kuriant genų bibliotekas, gaminant specialius baltymus, vitaminus, antibiotikus, hormonus, seka ir kartojant organizmų genomus, atliekant daugybę individų DNR kopijų kriminalistikoje ir kt..

Pav ._1: genų klonavimas

Kas yra PGR?

Polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra technika, kuria sukuriamas didelis skaičius tam tikro DNR fragmento kopijų. Specifinės DNR sekos eksponentinis amplifikavimas gaunamas PGR naudojant in vitro sąlygos. Šis metodas yra labai galingas molekulinės biologijos įrankis, nes jis gali padauginti nedidelį DNR mėginį į naudingą kiekį. Kary Mullis 1983 m. Pristatė PGR ir šis prizinis išradimas sukūrė didžiulę pažangą molekulinės biologijos srityje..

PGR metodu seka pakartotinės PGR reakcijos, kaip parodyta 0 pav. Vieną PGR reakciją sudaro trys pagrindiniai etapai, vykstantys trijose skirtingose ​​temperatūrose; DNR denatūravimas esant 94 ° C temperatūrai ⁰C, gruntų atkaitinimas 68 ° C temperatūroje ⁰C ir stygos pailgėjimas esant 72 ° C ⁰C. Todėl, kai atliekama PGR, reikia tinkamai išlaikyti temperatūros svyravimus, kad būtų galima tinkamai replikuoti. PGR atliekama PGR aparate PGR mėgintuvėlių viduje. PGR mėgintuvėliai užpildomi teisingais PGR mišiniais, kuriuose yra šablono DNR, Taq polimerazė, pradmenys, dNTP ir buferis. Dvigubos grandinės DNR denatūravimas į vienos grandinės DNR atliekamas skaldant vandenilio ryšius tarp komplementarių bazių esant 94 - 98 ⁰C. Tada atskiros šabloninės DNR grandinės yra veikiamos pradmenimis. Turi būti įrengta pora gruntų (į priekį ir atgal), kurie turi būti atsparūs šilumai, kad galėtų toleruoti aukštą temperatūrą. Pradmenys yra vienos grandinės trumpos DNR sekos, papildančios taikinio DNR fragmento galus. PGR naudojami sintetiniai pradmenys. Pradmenys jungiasi su papildomomis mėginio DNR bazėmis ir inicijuoja naujos grandinės sintezę. Šį žingsnį katalizuoja fermentas, vadinamas Taq polimeraze; termostabilus DNR polimerazės fermentas, išskirtas iš „Thermus auqaticus“. Kai yra pradmenų ir nukleotidų (statybinių blokų), Taq polimerazė konstruoja naują DNR grandinę, papildančią šabloninę DNR. Pasibaigus PGR programai, naudojant gelio elektroforezę, stebimas amplifikuoto DNR fragmentas. Jei reikia atlikti papildomą analizę, PGR produktas išvalomas iš gelio.

PGR yra labai naudinga diagnozuojant ir stebint genetines ir įgytas ligas, identifikuojant nusikaltėlius (teismo ekspertizės srityje), tiriant tikslinio DNR segmento struktūrą ir funkcijas, seka ir kartojant organizmų genomus ir kt. PGR tapo įprasta laboratorinių tyrimų metodika medicinos ir molekulinės biologijos tyrimų laboratorijose tarp mokslininkų, nes ji gali būti naudojama labai įvairiai.

2 pav. Polimerazės grandininė reakcija

Kuo skiriasi genų klonavimas ir PGR?

Genų klonavimas prieš PGR
Genų klonavimas yra kelių konkretaus geno kopijų darymo procesas in vivo per rekombinantinę DNR ir virsta bakterija šeimininke.	PGR metodu gaunamos kelios tam tikros DNR sekos kopijos in vitro per pakartotinius PGR reakcijų ciklus.
Reikalavimas sukurti rekombinantinę DNR
Norint nustatyti geną, gaminama rekombinantinė DNR.	Rekombinantinė DNR negaminama.
Darbo poreikis
Šis procesas reikalauja daug darbo.	Intensyvus darbas nėra būtinas.
In vivo arba in vitro procesas
Rekombinantinės DNR konstravimas yra in vitro o DNR amplifikacija yra in vivo.	DNR amplifikacija vyksta visiškai in vitro.

Santrauka - genų klonavimas prieš PGR

Genų klonavimas ir PGR yra du metodai, naudojami DNR amplifikacijai. PGR yra in vitro procesas, kurio metu atkuriamos kelios tam tikro DNR fragmento DNR kopijos, nenaudojant rekombinantinės DNR ir organizmo-šeimininko. Genų klonavimas visų pirma yra in vivo procesas, kurio metu gaunamos kelios dominančio geno kopijos priimančiojo organizmo viduje, sukuriant rekombinantinę DNR. Tai yra skirtumas tarp genų klonavimo ir PGR.

Nuoroda:
1. Griffithsas, Anthony JF. „Konkretaus geno klonavimas“. Šiuolaikinė genetinė analizė. JAV nacionalinė medicinos biblioteka, 1999 m. Sausio 1 d. Internetas. 2017 vasario 22
2. „Polimerazės grandininė reakcija (PGR).“ Nacionalinis biotechnologijų informacijos centras. JAV nacionalinė medicinos biblioteka, n.d. Žiniatinklis. 2017 vasario 22

Vaizdo mandagumas:
1. „17 01 06 pav.“, Pateikė „CNX OpenStax“ - (CC BY 4.0) per „Commons Wikimedia“
2. „PCR“ - „Madprime“ - Nuosavas darbas (CC BY-SA 3.0) per „Commons Wikimedia“