Skirtumas tarp Sanger sekos ir Pirosequencing

Pagrindinis skirtumas - „Sanger“ sekvenavimas prieš pirosekvinizavimą
 

DNR seka yra labai svarbi atliekant DNR analizę, nes žinios apie teisingą nukleotidų išdėstymą tam tikrame DNR regione atskleidžia daug svarbios informacijos apie tai. Yra skirtingi DNR sekos nustatymo metodai. Sangerio sekos nustatymas ir pirosekvensavimas yra du skirtingi DNR sekos nustatymo metodai, plačiai naudojami molekulinėje biologijoje. Pagrindinis skirtumas tarp Sanger sekos ir Pirosequencing yra tas Sangerio seka naudoja dideoksinukleotidus, norėdama nutraukti DNR sintezę, kad nuskaitytų nukleotidų seką, o pirosekvencija nustato pirofosfato išsiskyrimą įtraukiant nukleotidus ir sintezuojant papildomą seką, kad būtų galima perskaityti tikslią sekos seką..

TURINYS
1. Apžvalga ir svarbiausias skirtumas
2. Kas yra „Sanger“ sekvenavimas
3. Kas yra pirosekvencija
4. Lyginimas iš šono - „Sanger“ sekvenavimas prieš pirosekvinizavimą
5. Santrauka

Kas yra „Sanger“ sekvenavimas?

Sangerio sekos nustatymas yra pirmosios kartos DNR sekos nustatymo metodas, kurį 1977 m. Sukūrė Frederikas Sangeris ir jo kolegijos. Jis taip pat žinomas kaip Grandinės nutraukimo sekos arba Dideoksi seka nes jis pagrįstas dideoksinukleotidų (ddNTP) grandinės nutraukimu. Šis metodas buvo plačiai naudojamas daugiau nei 30 metų, kol buvo sukurta naujos kartos seka (NGS). Sangerio sekos sudarymo technika leido nustatyti teisingą nukleotidų tvarką arba prijungti tam tikrą DNR fragmentą. Tai pagrįsta selektyviu ddNTP įtraukimu ir DNR sintezės nutraukimu per in vitro DNR replikacija. Tai, kad nėra 3 'OH grupių, kad būtų galima tęsti fosfodiesterinių ryšių formavimąsi tarp gretimų nukleotidų, yra unikali ddNTPs savybė. Taigi, prijungus ddNTP, grandinės pailgėjimas nutrūksta ir pasibaigia nuo to taško. Yra keturi ddNTPs - ddATP, ddCTP, ddGTP ir ddTTP - naudojami Sangerio sekose. Šie nukleotidai sustabdo DNR replikacijos procesą, kai jie yra inkorporuoti į augančią DNR grandinę ir lemia įvairaus ilgio trumpąją DNR. Kapiliarinio gelio elektroforezė naudojama organizuoti šias trumpas DNR gijas pagal jų dydį ant gelio, kaip parodyta 01 paveiksle..

1 paveikslas: Susintetintos trumposios DNR kapiliarinio gelio elektroforezė

Dėl in vitro DNR replikacija, turėtų būti pateikti keli reikalavimai. Jie yra DNR polimerazės fermentas, šablono DNR, oligonukleotidų pradmenys ir deoksinukleotidai (dNTP). Atliekant Sangerio seką, DNR replikacija atliekama keturiuose atskiruose mėgintuvėliuose kartu su keturių tipų ddNTP atskirai. Dezoksinukleotidai nėra visiškai pakeisti atitinkamais ddNTP. Tam tikro dNTP mišinys (pavyzdžiui, dATP + ddATP) įpilamas į mėgintuvėlį ir pakartojamas. Keturi atskiri mėgintuvėlių produktai tepami ant gelio keturiuose atskiruose šuliniuose. Tada nuskaitant gelį, seką galima sudaryti taip, kaip parodyta 02 paveiksle.

02 paveikslas: Sanger seka

„Sanger“ seka yra svarbi technika, kuri padeda daugelyje molekulinės biologijos sričių. Žmogaus genomo projektas buvo sėkmingai baigtas naudojant Sanger sekos nustatymo metodus. „Sanger“ seka taip pat naudinga atliekant tikslinės DNR seką, nustatant vėžį ir genetines ligas, genų ekspresijos analizę, žmogaus identifikavimą, patogeno nustatymą, mikrobų seką..

Yra keli Sanger sekos trūkumai:

• Sekamos DNR ilgis negali būti ilgesnis kaip 1000 bazinių porų
• Vienu metu galima sekti tik vieną giją.
• Šis procesas reikalauja daug laiko ir yra brangus.

Todėl, siekiant įveikti šias problemas, laikui bėgant buvo sukurti nauji pažangūs sekų sudarymo būdai. Tačiau „Sanger“ seka vis dar naudojama dėl labai tikslių rezultatų iki maždaug 850 bazinių porų ilgio fragmentų.

Kas yra pirosequencing?

Pirosekvencija yra nauja DNR sekos sudarymo technika, pagrįsta „sekos sinteze“. Šis metodas remiasi pirofosfato išsiskyrimo nustatymu, įterpus nukleotidą. Procesą naudoja keturi skirtingi fermentai: DNR polimeras, ATP sulfurilazė, luciferazė ir apyrazė ir du substratai - adenozino 5 ’fosfosulfatas (APS) ir luciferinas..

Procesas prasideda nuo pradmens surišimo su vienos grandinės DNR šablonu, o DNR polimerazė pradeda papildyti nukleotidus. Kai nukleotidai susijungia (nukleorūgščių polimerizacija), jie išskiria pirofosfato (dvi fosfato grupės, sujungtos kartu) grupes ir energiją. Kiekvienas papildymas nukleotidu išskiria ekvimolinį kiekį pirofosfato. Pirofosfatas virsta ATP per ATP sulfurilazę, esant substrato APS. Sukurtas ATP skatina luciferozės sąlygojamą luciferino virsmą oksiuciferinu, sukurdamas matomos šviesos kiekį, proporcingą ATP kiekiui. Šviesą aptinka fotonų aptikimo įtaisas arba daugkartinis garsiakalbis ir sukuria pirrogramą. Apyrase skaido ATP ir neįtrauktus dNTPs reakcijos mišinyje. dNTP pridėjimas atliekamas vieną kartą. Kadangi yra žinoma, kad nukleotido pridėjimas priklauso nuo šviesos įtraukimo ir aptikimo, galima nustatyti šablono seką. Pirrograma naudojama mėginio DNR nukleotidų sekai generuoti, kaip parodyta 03 paveiksle.

Pirozės nustatymas yra labai svarbus atliekant vieno nukleotido polimorfizmo analizę ir nustatant seką trumpiems DNR ruožams. Didelis tikslumas, lankstumas, paprastumas automatizuoti ir lygiagretus apdorojimas yra pirosequencing pranašumai, palyginti su Sanger sekos sudarymo metodais..

03 paveikslas: Pirosekvencija

Kuo skiriasi „Sanger Sequencing“ ir „Pirosequencing“?

„Sanger“ sekvenavimas prieš pirosekvinizavimą
Sangerio sekos nustatymas yra DNR sekos nustatymo metodas, pagrįstas selektyviu ddNTPs įtraukimu į DNR polimerazę ir grandinės nutraukimu.	Pirosekvencija yra DNR sekos nustatymo metodas, pagrįstas pirofosfato išsiskyrimo įterpiant nukleotidą nustatymu..
DdNTP naudojimas
ddNTPs yra naudojami DNR replikacijai nutraukti	ddNTP nenaudojami.
Dalyvaujantys fermentai
Naudojama DNR polimerazė.	Naudojami keturi fermentai: DNR polimerazė, ATP sulfurilazė, luciferazė ir apyrazė.
Naudojami substratai
APS ir Luciferinas nenaudojami.	Naudojami adenozino 5 ’fosfosulfatas (APS) ir luciferinas.
Maksimali temperatūra
Tai lėtas procesas.	Tai greitas procesas.

Santrauka - „Sanger“ sekvenavimas prieš pirosekvinizavimą

Sangerio sekos nustatymas ir pirosekvensavimas yra du DNR sekos nustatymo metodai, naudojami molekulinėje biologijoje. „Sanger“ seka sukuria nukleotidų tvarką seka, nutraukdama grandinės pailgėjimą, tuo tarpu pirosekvencija sukuria tikslią nukleotidų seką seka, įterpdama nukleotidus ir aptikdama pirofosfatų išsiskyrimą. Todėl pagrindinis skirtumas tarp Sanger sekos ir Pirosequencing yra tai, kad Sanger sekos veikia sekos nustatymą grandinės nutraukimu, o pirosequencing veikia sekos sintezės būdu.

Nuoroda:
1. Fakruddin, Md ir Abhijit Chowdhury. „Pirosequencing“ - alternatyva tradiciniam Sangerio sekavimui. “ Amerikos žurnalas apie biochemiją ir biotechnologijas. Mokslo publikacijos, 2012 m. Kovo 2 d. Internetas. 2017 m. Vasario 28 d.
2. „Sanger seka“. „Sanger“ sekos - „ScienceDirect“ temos. N.p., n.d. Žiniatinklis. 2017 m. Vasario 28 d

Vaizdo mandagumas:
1. Christoph Goemans (modifiziert) „Didesoxy-Methode“ - dr. Norman Mauder, auf Basin einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) per Commons Wikimedia
2. „Sanger-DNA-seq“, autorius Enzo lenkų kalbos Vikipedijoje (CC BY-SA 3.0) per „Commons Wikimedia“
3. „Pirosequencing“, atliekamas per mikrobiologinius baitus (CC BY-SA 2.0) per „Flickr“